高效气相色谱仪测定人血浆中硝酸异山梨酯浓度的方法安陆
发布时间:2022-08-24 00:25:48 来源:泓佳机械网
高效气相色谱仪测定人血浆中硝酸异山梨酯浓度的方法
高效气相色谱仪测定人血浆中硝酸异山梨酯浓度的色谱条件:1、仪器:高效气相色谱仪2、检测器:ECD3、色谱柱:石英毛细管柱OV-101(25m×0.25mm I.D.,膜厚0.22um Shimadzu)4、载气:高纯氮气5、载气流速:1.25mL/min6、分流比:1:807、尾吹气流速:20mL/min8、进样口温度:200℃9、检测器温度:250℃10、程序升温:起始柱温150℃,保持9min,以40℃/min的速率升至200℃,保持7mim。一、血浆样品的提取:精密量取样品血浆1mL,加入内标溶液40uL,涡旋处理10s,加乙酸乙酯5mL,涡旋处提取3min,离心(3500rpm)10min,取有机相4.5mL,于50℃水浴上用氮气流吹干,残渣加乙酸乙酯50uL溶解后,精取2uL进样。二、检测器的选择:1、硝酸异山梨酯气雾剂给药后血药浓度很低,较高血药浓度在10ng/mL以下,较低定量限至少应达到0.1ng/mL,FID检测器无法满足测定要求。2、硝酸异山梨酯的结构中含有两个硝酸酯基,硝酸酯基具有限强的亲电性,捕获电子的能力很强,因此在ECD上具有很高的响应。3、ECD为痕量分析检测器,对亲电性物质的检测响应很高,可以达到纳克级水平,故人血浆中硝酸异山梨酯的浓度测定采用ECD。4、载气和尾吹气的流速:ECD应使用高纯度的氮气,并需经脱氧脱气、分子筛脱水。载气流速主要从组分分离要求确定,尾吹气根据目标峰的峰形、峰面积或峰高和基线来确定。可通过实验确定。三、色谱柱类型的选择:1、硝酸异山梨酯气雾剂给药后血药浓度很低,较高血药浓度在10ng/mL以下,要求方法有很高的灵敏度。2、血浆样品较为复杂,干扰物多,要求有很高的分离效果。3、毛细管柱柱效远远高于填充柱,出峰尖锐,灵敏度高,因此痕量分析中优于填充柱。毛细管柱分离效果远远高于填充柱。故人血浆中硝酸异山梨酯的浓度测定选用毛细管柱。4、固定相的选择:检测器为ECD,尽量不要选择含多卤原子的固定相,如甲基三氟丙基聚氧烷(QF-1、OV-210)和聚三氟氯乙烯蜡等。本实验选择了实验室常用的OV-101石英毛细管柱。5、毛细管柱的柱管选择:兼顾柱效和样品容量,选择常规毛细管柱为柱长25m、内径0.25mm和膜厚0.22um的石英毛细管柱。四、内标的选择:1、体内药物分析中生物样品的处理很复杂,每一步都有可能导致样品的损失,为校正误差,需在样品处理前加入内标物,一般选择内标法。2、内标物的选择:本实验选择3,5-二硝基氯苯。(1)内标物与目标成分的脂溶性、挥发性、在OV-101固定液上色谱保留相似。(2)3,5-二硝基氯苯含有二个硝基,与硝酸异山梨酯一样在ECD上有很高的响应。五、柱温的选择:程序升温:起始柱温150℃,保持9min,以40℃/min的速率升至200℃,保持7min。1、选择程序升温:硝酸异山梨酯与内标物3,5-二硝基氯苯在起始柱温150℃,保持9min内已出峰,恒温条件可达完整分离,实验显示,样品在目标峰与内标物峰之后仍有血浆中其它物质峰,因此后续升温只是为了洗脱出血浆中其它物质,以便下一次进样分析。2、程序升温方式的选择:恒温-线性升温-恒温。理由:起始柱温150℃,保持9min,使硝酸异山梨酯与3,5-二硝基氯苯在该温度下获得完整分离,然后以仪器允许设置的较大升温速率(40℃/min)将柱温升至200℃并保持7min以洗脱本次进样带入的色谱保留较大其它物质,为下一次进样分析做准备。六、进样口温度(气化室温度)与检测器温度的选择:进样口温度200℃,检测器温度250℃。1、进样口温度:200℃以上时硝酸异山梨酯破坏较多,200℃以下时硝酸异山梨酯气化不完整,故进样口温度设置为200℃。2、检测器温度:一般检测器温度与进样口温度相同,但实验显示,250℃时ECD对硝酸异山梨酯的响应较大,本实验ECD温度设置为250℃。3、较高柱温:为保护检测器,以防柱中流出物在检测器上凝结,污染检测器,检测器温度至少比柱温高30℃,即本实验柱温较高可设置到220℃,并减少维持时间。
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